PCR

http://group.keyangou.com/PCR
组长: 管理员:
  • 访问次数:2340
  • 小组等级:3
  • 话题:3
  • 回答:1
  • 签到:88
  • 小组排名:
  • 样本制备及注意事项

    biotnt | 2016-11-08 17:30 | 0
    一、PCR 实验中细胞的采集、处理和保存 1、细胞板贴壁细胞直接裂解:细胞弃培养上清,加入适量裂解液(如:1ml的Trizol)重悬细胞(过量会降低浓度,很重要),超声破碎或用枪吹打200下;2、细胞团块裂解:细胞团块加1ml PBS重悬(注意不要过于剧烈造成细胞破裂),1000rpm离心5分钟,弃上清,重复3次,加适量Trizol重悬(过量会降低浓度,很重要),超声破碎或用枪吹打200下;3、悬浮细胞裂解:转移至EP管,1000rpm离心5分钟,弃上清,加适量Trizol重悬(过量会降低浓度,很重要),超声破碎或用枪吹打200下;4.保存上述步骤处理完后,将细胞放入冰箱冻存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)-20℃下,可放置保存1个月;-80℃下,可放置保存6个月;  二、PCR 实验中易碎组织(脑、肝、肾)的采集、处理和保存 1、样品按50-100mg,加入1mlTrizol,另外组织体积不能超过Trizol体积的10%。否则匀浆效果不好,且组织块太多,会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA发生降解2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;3、冰水浴中电动匀浆机(每个样本20-30s)或超声破碎;4、保存上述步骤处理完后,将细胞放入冰箱冻存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)-20℃下,可放置保存1个月;-80℃下,可放置保存6个月;  三、PCR实验中不易碎组织如(心肌、肌肉组织)的采集、处理和保存 1、样品按50-100mg,加入1mlTrizol,放入冰箱,静置3小时2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;4、保存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)-20℃下,可放置保存1个月;-80℃下,可放置保存6个月;备注:心肌、肌肉组织无法用匀浆机匀浆,组织块会绞入钻头形成团块,无法被匀浆机刀头切碎,需用研磨或超声才能充分破碎。  四、PCR实验中上皮组织(皮肤、膀胱、肠)的采集、处理和保存 1、样品按50-100mg,加入1mlTrizol,放入冰箱,静置3小时2、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块;3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;4、保存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)-20℃下,可放置保存1个月;-80℃下,可放置保存6个月备注:上皮组织韧性较强,较难剪碎,需要增加组织破碎时间才能充分破碎。  五、PCR实验中小颗粒组织(如:神经节、小鼠眼角膜、巩膜、韧带)的采集、处理和保存 1、加入1mlTrizol2、冰水浴中用显微剪剪碎组织块;3、冰水浴中研磨棒研磨或超声破碎;4、保存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)-20℃下,可放置保存1个月;-80℃下,可放置保存6个月 备注:小颗粒组织量比较小,会有RNA量低于检测限度的风险,且样本量太少,无法被匀浆机刀头切碎,需用研磨或超声才能充分破碎。研磨时应格外细心。  六、PCR实验中骨头组织的采集、处理和保存 1、用已消毒过的咬骨钳将骨组织咬碎2、加入1mlTrizol,放入冰箱,浸泡半天,使骨头软化3、冰水浴中用眼科剪剪碎组织块4、冰水浴中电动匀浆机(每个样本20-30s)或超声破碎;5、保存上述步骤处理完后,将细胞放入冰箱冻存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)-20℃下,可放置保存1个月;-80℃下,可放置保存6个月。  七、PCR实验中全血的采集、处理和保存 1、采集血样,室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可;血量一般为1ml2、从全血中提取淋巴细胞后,加入1ml的Trizol裂解淋巴细胞(全血提取淋巴细胞见附录)3、超声破碎或用枪吹打200下4、保存将细胞放入冰箱冻存(不应反复冻融,否则会使RNA降解)-20℃下,可放置保存1个月;-80℃下,可放置保存6个月;备注:全血千万不能放入干冰中送样,应室温保存  附录I:qPCR样本制备的注意事项 足量的并且保证纯度的细胞或组织 1、取动物的组织,动作要求迅速,尽量避免样本在环境中暴露太久;2、将组织或细胞迅速放入无菌无酶的冻存管中,为保证质量,推荐选取Axygen,corning,nunc等国外品牌的冻存管;3、在冻存管上做好标记,尽量清晰易辨;在实验记录本上做好记录,尽量详细易查;4、将冻存管直接放入液氮中速冻;或加入1ml Trizol 到冻存管中,再放入液氮速冻;5、速冻2h 后,将冻存管从液氮转至-80度冰箱,可以保存6个月左右;6、尽量及早提取组织或细胞样本中的RNA并逆转录为cDNA,因为即使冻存,降解仍然存在。样本运输:液氮或干冰运输7、全血千万不能放入干冰中送样,应室温保存,且采集完全血后,应尽快处理,从其中分离出所需的淋巴细胞  附录II:经典Trizol法制备RNA注意事项 1、  RNA很容易降解,实验时一般都要求实验人员的穿戴齐备外,还需要注意环境是否有大量空气流通和污染。2、  关于Trizol,Trizol中主要作用的成分是异硫氰酸胍及RNA酶抑制剂,能很好保护RNA不被降解,并且使RNA更易从组织或细胞中释放出来,但要注意的是,1ml的Trizol最多只能裂解100mg的组织,Trizol无法完全浸润组织无法完全裂解组织,过多组织内的RNA酶等物质会导致RNA的降解。这是RNA降解的很重要的原因。3、  氯仿萃取后离心分层取上清这一步中,没有必要吸干上层水相,因为误吸入水相和有机相中间夹层中的基因组DNA导致污染远比损耗1-2倍的RNA结果要严重的多。4、  RNA的沉淀有无并不决定RNA制备的成功与否,肉眼不可见的RNA也能跑出非常漂亮的PCR条带或曲线。5、  记住,Trizol法提取的RNA为总RNA,mRNA和microRNA在其中占比并不大,大部分是rRNA,所以用测RNA浓度或电泳法检验RNA的质量是无法直观反映mRNA和microRNA的质量,建议直接PCR跑个内参试试。 
    科研狗 2012-2016 京ICP备16006621 科研好助手,专业的科研社交共享平台